Efecto del estrés nutricional en células de Y. lipolytica en ausencia de los genes GPA

La subunidad de la proteína G heterotrimérica participa en la activación de la Proteína Kinasa dependiente de AMPc (PKA); esta proteína esta implicada en diferentes procesos biológicos como crecimiento, proliferación y sensado de nutrientes. La vía PKA -y sus componentes- están conservados en distintos organismos eucariotas, desde los hongos hasta los humanos.
En la levadura Yarrowia lipolytica se han identificado los genes GPA1 y GPA2 que codifican para la subunidad Ga. Las células mutantes generadas a partir de la deleción del gen GPA1 no mostraron cambios tanto en la morfología como en el crecimiento al utilizar diferentes concentraciones de glucosa ni al cambiar la fuente de carbono (por glicerol); lo que sugiere que posiblemente la deleción de ambos genes GPA afecte el sensado de nutrientes en Y. lipolytica. En el presente estudio se generó una doble mutante carente de los genes GPA1 y GPA2 de Y. lipolytica; partiendo de cassettes de disrupción previamente clonados en el plásmido pCR TOPO4 y E. coli (Huerta, 2014). Los cassettes se amplificaron por PCR y los productos se purificaron a partir de geles de agarosa. En paralelo, se generaron células litio-competentes de Y. lipolytica (gpa1-a) a las cuales se les realizó el proceso de transformación por choque térmico (37ºC, 10 min). Las células ya transformadas se cultivaron en placas de Petri con medio selectivo YNB (sin adición de leucina o uracilo), se incubaron a 28ºC por 6 días. Se seleccionaron las colonias aisladas, las cuales fueron cultivadas en medio YNB líquido para realizar el análisis genotípico (por PCR y por digestión enzimática) y se identificó una doble mutante (gpa1-a/gpa2-a). En el análisis fenotípico se observó que la morfología de las células correspondientes a la cepa doble mutante gpa1-a/gpa2-a al cultivarla en medio rico en nutrientes (YPD) permanecío en forma de levadura, de manera similar que la cepa control, pero al cultivarla en medio mínimo YNB adicionado con glucosa (1, 2 y 4%) dicha morfología era predomintemente en forma de hifa. Para comparar el crecimiento de la doble mutante gpa1-a/gpa2-a, con respecto a la cepa parental, se realizó un análisis cuantitativo cuyos resultados indican que la mutante no creció en medio sin glucosa, por el contrario al cultivarla en presencia de glucosa el crecimiento de la mutante fue mayor, con respecto a lo observado en la cepa parental. Los resultados indican que en las células carentes de los genes GPA está alterada tanto su capacidad dimorfica como su velocidad de crecimiento, cuando son sometidas a condiciones de estrés nutricional.